核酸檢測室氣溶膠產(chǎn)生及預(yù)防

    核酸檢測實驗是微觀的，基于細(xì)胞，分子，蛋白水平，而這些微觀樣本對外界環(huán)境的影響敏感，比如溫度、ph值、酶解、損傷等，在我們盡力呵護樣本的生存環(huán)境的同時，污染也是需要注意的頭等大事，要堅決避免環(huán)境中的“雜質(zhì)”的亂入，包括樣本污染，試劑儀器交叉污染、產(chǎn)物氣溶膠污染等對實驗結(jié)果的影響。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，防不勝防，假陽性結(jié)果讓無數(shù)核酸檢測人員抓狂和崩潰。
   一旦出現(xiàn)實驗室環(huán)境污染，比如樣本之間交叉污染、試劑污染、儀器污染、陽性對照污染、PCR擴增產(chǎn)物污染、氣溶膠污染等，其中氣溶膠污染是一個非常重要而被忽視的污染源。實驗室出現(xiàn)氣溶膠污染，需要較長的時間進行*。
 
一、氣溶膠污染原因
1、樣本之間交叉污染。
標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染；標(biāo)本存放運輸時，由于密封不嚴(yán)或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；核酸模板在提取過程中，由于加樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；手動提取核酸樣本時，污染的手套觸摸離心管內(nèi)蓋導(dǎo)致的污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導(dǎo)致彼此間的污染。
2、PCR試劑污染
PCR試劑在配制過程中，移液槍、槍頭、離心管等原因造成試劑被PCR核酸模板污染。
3、不同工作區(qū)域移液槍等耗材交叉使用。
 將易污染區(qū)域的移液槍、槍頭、離心管等耗材拿到潔凈區(qū)使用引起的污染；
4、離心機轉(zhuǎn)子未定期擦拭。
離心機通常進行各種試劑組分、不同盲樣的離心，如果離心管外部沾染病毒、陽性核酸或陽性質(zhì)粒，容易造成污染。
5、陽性對照造成的污染。
開蓋時間過長高濃度質(zhì)粒揮發(fā)到室內(nèi)，陽性對照組分未使用完任意丟棄，加完陽性對照的槍頭未放入消毒液中。
6、擴增產(chǎn)物開蓋造成的污染。
這是PCR試驗中主要、常見的污染原因。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測拷貝的極限，PCR產(chǎn)物開蓋后，極易迅速造成擴散，極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。
7、各個實驗室擦桌布、掃把，簸箕，工作服交叉使用。
 
二、核酸檢測實驗室如何預(yù)防污染
1、合理的實驗分區(qū)
原則上可以設(shè)置3個獨立的工作區(qū)域：
試劑耗材儲存與準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理和標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)（核酸純化）、擴增檢測區(qū)，各區(qū)域空間*相互獨立，不能直接相通。其中試劑耗材儲存與準(zhǔn)備區(qū)必須獨立設(shè)置。
實驗室實施空氣流向控制，擴增前和擴增后區(qū)域應(yīng)具有獨立通風(fēng)系統(tǒng)，擴增后區(qū)域保持負(fù)壓狀態(tài)，其它區(qū)域保持正壓狀態(tài)，防止擴增產(chǎn)物進入擴增前的區(qū)域。
 
2、實驗操作流程：
（1）樣品制備區(qū)進行樣品處理，核酸提取；
（2）配液區(qū)配置反應(yīng)體系：酶混合液和PCR反應(yīng)液混合，分裝至PCR反應(yīng)管；
（3）樣品制備區(qū)加樣：樣品核酸和陰陽性對照加至反應(yīng)液中；
（4）PCR擴增區(qū)上機擴增檢測。務(wù)必保持單向操作流程，避免各區(qū)實驗室污染。
3、各個實驗區(qū)內(nèi)試驗用品專區(qū)
配液區(qū)是潔凈的試驗區(qū)域，樣品制備區(qū)的潔凈度稍差， PCR擴增區(qū)內(nèi)是易被污染的區(qū)域，各區(qū)之間試驗物品專區(qū)，避免因交叉使用造成實驗室污染。
4、試驗操作要規(guī)范
    （1）正確使用移液槍，保證試劑配比和計量正確，同時避免液體吸入移液槍口造成污染。
    （2）實驗的過程中應(yīng)勤換手套，在進出不同區(qū)域或進行模板操作后，都應(yīng)及時更換手套。
    （3）試劑盒各組分在打開之前應(yīng)先做瞬時離心(約10s)，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部，從而減少污染手套或加樣器的機會。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠，造成污染。
    （4）樣本量較多時，應(yīng)將反應(yīng)液預(yù)混，再分裝至PCR反應(yīng)管，后添加核酸模板，以減少單個添加操作繁瑣造成的污染。
    （5）每次試驗必須設(shè)定陰性對照和陽性對照，讀取結(jié)果時，在保證陰陽性對照均成立的情況下，判讀樣本結(jié)果才有效。
（6）實驗結(jié)束后，PCR反應(yīng)管嚴(yán)禁打開，及時放置殺孢子劑消毒液中浸泡。
 
三、解決核酸實驗室污染方法
（1）開窗通風(fēng)：如在短時間內(nèi)要消除實驗室污染，開窗通風(fēng)促進實驗室內(nèi)空氣流通，使停留在室內(nèi)的核酸排放到室外。
（2）紫外燈照射：將實驗室內(nèi)好生物安全柜內(nèi)物品平鋪，打開離心機內(nèi)蓋，然后將紫外等打開照射12-24小時，通風(fēng)12小時以上。
（3）消毒液降解核酸：及時用諾福過氧化氫殺孢子劑擦拭操作臺面和儀器，按照1:10稀釋浸泡試驗器具，同時按照1:3比例稀釋涮洗拖布擦拭地面。
（4）高壓：試驗耗材、工作衣等進行121℃30分鐘高壓。

（5）使用核酸污染清洗液噴灑室內(nèi)降解核酸。

（6）陽性污染特別嚴(yán)重，可以采取干霧過氧化氫消毒熏蒸實驗室。

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